Научно-практическая конференция и школа с международным участием, посвященная 90-летию со дня рождения академика В.В.Фролькиса

ВЛИЯНИЕ ГОМОАГРЕГАТНОЙ И ЛИПОСОМНОЙ ФОРМ β-АМИЛОИДНОГО ПЕП-ТИДА 40 НА МОНОНУКЛЕАРЫ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРЫС IN VITRO

2014

β-Амилоидный пептид 40 (βА40) является частью врожденного иммунитета ЦНС многоклеточных организмов. Его агрегацию и отложение в амилоидных бляшках рассматривают в качестве ведущего механизма патогенеза болезни Альцгеймера (БА). В наших предыдущих исследованиях было показано, что моделирование доклинического этапа БА у крыс интрацеребральным введением βА40_Human сопровождалось активацией цитокинового звена нейровоспаления. Поэтому целью данной работы стало исследование токсичности βА40_Human в гомоагрегатной и липосомной формах и его эффект на цитокиновый статус мононуклеаров крыс. Методы. Мононуклеары выделяли на градиенте фиколла/урографина из цельной крови животных. Суспензию клеток (66∙109 клеток/л) в PBS (pH 7,4) инкубировали при 37oC 2 и 24 часа с βА40_Human (15нМ) в гомоагрегатной и липосомной формах. В пробах до и после инкубации спекрофотометрически определяли целостность клеточных мембран по связыванию нейтрального красного и общую метаболическую активность клеток в тесте окисления ресазурина (In vitro TOXICOLOGY assay kit). Иммуноферментным методом регистрировали уровень цитокинов IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10 (Rat ELISA kit Invitrogen BCM Dianostics, USA). Статистический анализ данных выполняли в программе Statistica 6.0. Критическим уровнем значимости различий по t-критерию Стьюдента считали 0,05. Результаты. Установили, что двухчасовая инкубация мононуклеаров с человеческим βА40 in vitro вызывала угнетение активного транспорта нейтрального красного, а суточная – деструкцию мембран и неспецифическое связывание с ними витального красителя. Гомоагрегатная форма βА40 проявляла большую агрессивность к липидным мембранам, по сравнению с липосомной. К 2 ч воздействия гомоагрегаты βА40_Human не вызывали угнетение общей метаболической активности мононуклеаров, тогда как его липосомная форма обусловила снижение внутриклеточного окисления ресазурина. Через 24 часа метаболическая активность мононуклеаров составляла всего 12-13% исходного уровня независимо от действующей формы βА40_Human. Ранние эффекты (2 ч) гомоагрегатов βА40_Human сопровождались лишь некоторым снижением уровня провоспалительных цитокинов (IL-1β и TNF-α), тогда как в составе липосом этот пептид вызывал повышение концентрации IL-1β, IL-6 и IL-10. Через сутки инкубации мононуклеаров с гомоагрегатным βА40_Human сохранялся сниженный уровень TNF-α и только теперь повышалась концентрация IL-6. Для липосомной формы пептида в этот период были зафиксированы нормализация концентрации IL-1β и дальнейший рост уровней IL-6 и IL-10. Выводы. Токсичность гомоагрегатов βА40_Human in vitro проявлялась нарушением активного транспорта мембран, угнетением цитокинов и подавлением общей метаболической активности мононуклеаров. Напротив, βА40_Human в структуре липосом вызывал активацию цитокиновой системы, особенно её противовоспалительных звеньев.